Sinalização rápida por testosterona na membrana plasmática da célula de sertoli : captação de 45Ca2+ e efeitos eletrofisiológicos

Resumo não disponível.

A concentração, a composição e a qualidade do plasma seminal na preservação do sêmen eqüino a +4ºC.

O presente trabalho constou de três experimentos. O primeiro objetivou verificar a influência de diferentes concentrações de plasma seminal e de dois diluentes na motilidade e na integridade e funcionalidade da membrana plasmática de espermatozóides eqüinos resfriados. Para tanto, foram utilizados 4 garanhões, comprovadamente férteis e em atividade sexual. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado, diluído 1:2 com EDTA-glicose, dividido em oito alíquotas e centrifugado a 600g, por 10 minutos, para remoção do plasma seminal. O pellet de cada alíquota foi ressuspendido com um determinado volume do plasma seminal, previamente removido e acrescido de um determinado volume de um dos dois diluente (leite desnatado UHT ou leite desnatado-glicose) até atingir uma concentração final entre 40 e 50x106 espermatozóides/ml, contendo as seguintes concentrações finais de plasma seminal: 0%, 2,5%, 5% e 10%. Imediatamente após a diluição, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade progressiva e total e funcionalidade e integridade da membrana plasmática. A seguir, os oito frascos contendo o sêmen, com um volume aproximado de 12 ml cada, foram resfriados em câmara a +4ºC a uma taxa de resfriamento de 0,3º C/min, sendo o sêmen novamente avaliado às 24, 48 e 72 horas.

Efeito da administração aguda de arginina sobre aspectos bioquímicos e comportamentais em ratos adultos

Os erros inatos do metabolismo (EIM) constituem um grupo de doenças genéticas causadas pela deficiência ou ausência de uma proteína, geralmente uma enzima. A hiperargininemia é um erro inato do ciclo da uréia causado pela deficiência de arginase, enzima que converte a arginina em ornitina e uréia. O bloqueio desta reação resulta no acúmulo tecidual e plasmático de arginina e seus metabólitos, os compostos guanidínicos. As manifestações clínicas desta doença diferem substancialmente das demais doenças metabólicas do ciclo da uréia. Seus principais sintomas, que manifestam-se progressivamente, são caracterizados por espasticidade, epilepsia e retardo mental. A correlação entre o metabolismo da arginina e do óxido nítrico ocorre no chamado ciclo arginina-citrulina. A arginina é o substrato para a síntese de óxido nítrico pela ação da enzima óxido nítrico sintetase (ONS). Como os pacientes hiperargininêmicos apresentam altos níveis de arginina no plasma e tecidos, é provável que, devido ao excesso deste substrato, ocorra um aumento na síntese de óxido nítrico. O óxido nítrico em concentrações elevadas está associado à produção de radicais livres, neurotoxicidade e inibição da enzima Na+,K+-ATPase. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental ao funcionamento normal do sistema nervoso central (SNC), pois regula a transmissão do impulso nervoso, o volume celular e o transporte de moléculas ligadas ao cotransporte de Na+, tais como aminoácidos, glicose e neurotransmissores. A inibição da atividade da Na+,K+-ATPase nos sítios pré-sinápticos resulta na inibição da recaptação de glutamato, bem como na estimulação de sua liberação. A inibição desta enzima também tem sido associada a diversas neuropatologias. A Na+,K+-ATPase também está envolvida na LTP (long term potentiation – potenciação de longa duração), que é um tipo de neuroplasticidade celular que provoca alterações nas cascatas bioquímicas no SNC, que são, muitas vezes, idênticas àquelas que ocorrem durante o processo de formação da memória. Assim, acredita-se que a LTP seja um dos diversos mecanismos bioquímicos importantes para a formação da memória. Neste estudo investigamos o efeito in vivo da administração aguda de arginina, L-NAME (um potente inibidor da ONS) e a co-administração de Arg + L-NAME sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica de hipocampo de ratos adultos e sobre testes 6 comportamentais utilizados para avaliar o aprendizado e memória: campo aberto e esquiva inibitória. Os resultados obtidos demonstraram que a arginina inibiu significativamente a atividade da enzima Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica de hipocampo de ratos. A administração de L-NAME não alterou a atividade da enzima, mas preveniu a diminuição da atividade da Na+,K+-ATPase causada pela arginina. Nos experimentos de comportamento foram avaliados o aprendizado, a consolidação e a evocação da memória de longa duração pela administração das soluções em três momentos diferentes. A arginina diminuiu o desempenho do teste de esquiva inibitória nos três momentos, o L-NAME isoladamente não alterou o comportamento dos animais, mas quando co-administrado com a arginina aumentou a capacidade de memorização desta tarefa. Estes resultados indicam que a administração de arginina in vivo reduz tanto a atividade da Na+,K+-ATPase como a modulação da memória em ratos, e que isso ocorreu, provavelmente, pelo aumento da síntese de óxido nítrico. Assumindo a possibilidade de que isso possa ocorrer em pacientes com hiperargininemia, os resultados obtidos podem ser relevantes para explicar, pelo menos em parte, a disfunção neurológica associada a essa doença.

Efeito in vivo e in vitro da prolina sobre a atividade da Na+, K+-ATPase de cérebro de ratos

A hiperprolinemia tipo II é um erro inato do metabolismo de aminoácido causado pela deficiência na atividade da Ä1 pirrolino-5-carboxilato desidrogenase. O bloqueio dessa reação resulta no acúmulo tecidual de prolina. A doença caracteriza-se fundamentalmente por epilepsia, convulsões e um grau variável de retardo mental, cuja etiopatogenia ainda é desconhecida. No tecido nervoso, a Na+, K+ - ATPase controla o ambiente iônico relacionado com a atividade neuronal, regulando o volume celular, o fluxo de íons e o transporte de moléculas ligadas ao transporte de Na+, tais como, aminoácidos, neurotransmissores e glicose. Evidências na literatura mostram que recém nascidos humanos com baixos níveis de Na+, K+ -ATPase cerebral apresentam epilepsia e degeneração espongiforme. Alterações na atividade desta enzima têm sido associadas a várias doenças que afetam o sistema nervoso central, como isquemia cerebral e doença de Parkinson. Considerando que a inibição da Na+, K+ - ATPase por ouabaína tem sido associada com liberação de neurotransmissores, incluindo glutamato, em uma variedade de preparações neuronais, e que alguns autores sugerem que o efeito da prolina sobre a sinapse glutamatérgica possa ser, pelo menos em parte, responsável pelos sintomas neurológicos encontrados nos pacientes com hiperprolinemia, no presente trabalho verificamos efeitos dos modelos experimentais agudo e crônico de hiperprolinemia tipo II sobre a atividade da Na+, K+ - ATPase de membrana plasmática sináptica de córtex cerebral e hipocampo de ratos. No modelo crônico, a prolina foi administrada a ratos Wistar duas vezes ao dia do 6o ao 28o dia de vida, enquanto que no modelo agudo os animais, com 15 dias de vida, receberam uma única injeção de prolina e foram sacrificados 1hora após a administração da droga. Os animais tratados crônicamente com prolina não apresentaram alterações significativas no peso corporal, do encéfalo, do hipocampo e do córtex cerebral, bem como nas quantidades de proteínas do homogenizado cerebral e da membrana plasmática sináptica de córtex cerebral e hipocampo. Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa na atividade da Na+, K+ - ATPase de membrana plasmática sináptica de cérebro de animais tratados aguda e crônicamente com prolina. Foram também testados os efeitos in vitro da prolina e do glutamato sobre a atividade da Na+, K+- ATPase. Os resultados mostraram que os dois aminoácidos, nas concentrações de 1,0 e 2,0 mM, inibiram significativamente a atividade da enzima. O estudo da interação cinética entre prolina e glutamato, sugere a existência de um sítio único de ligação na Na+, K+ - ATPase para os dois aminoácidos. É possível que a inibição na atividade da Na+, K+- ATPase possa estar envolvida nos mecanismos pelos quais a prolina é neurotóxica. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da disfunção neurológica encontrada em pacientes com hiperprolinemia tipo II.

A importância da seqüência de administração do irinotecan e 5-fluorouracil na inibição da proliferação do carcinoma de cólon humano in vitro

O câncer colorretal é um dos tumores humanos mais freqüentes e a terceira causa de morte relacionada ao câncer no mundo. Apesar de importantes progressos terapêuticos, os resultados na doença avançada ainda são muito modestos. Isto deve-se ao fato de que a droga mais utilizada nesta neoplasia, o antimetabólito 5-fluorouracil (5-FU), foi desenvolvido a mais de 40 anos produzindo taxas de respostas de somente 10-15%. Recentemente, o inibidor da topoisomerase I irinotecan (CPT-11) demonstrou, em carcinoma de cólon avançado, respostas comparáveis tanto em pacientes não tratados quanto naqueles que tiveram recaída após terapia com 5-FU. Estes resultados justificam a avaliação da combinação 5-FU/CPT-11 nesta doença. Apesar das respostas dos estudos clínicos serem promissoras, a melhor seqüência de administração destes agentes ainda não foi determinada. Neste estudo, avaliamos a combinação CPT-11/5-FU quanto ao aumento da inibição do crescimento celular quando comparada com os agentes sozinhos nas linhagens celulares de carcinoma de cólon humano SW620, HT-29 e SNU-C4. Para isto, as células foram expostas às drogas sozinhas ou a várias combinações e seqüências de dose baixa e fixa (IC20) de um dos agentes na presença de dose alta e seriada do outro. As células foram avaliadas imediatamente após os tratamentos e/ou cultivadas por mais 2 dias em meio de cultura sem drogas através de coloração com sulforodamina B. As interações entre CPT-11 e 5-FU foram avaliadas por um programa de computador que permite calcular os índices de combinação (CIs) das drogas indicando sinergismo, adição, ou antagonismo (CI < 1, = 1, ou > 1, respectivamente). As respostas celulares foram relacionadas com as atividades das enzimas timidilato sintase, topoisomerase I e carboxil esterase, que foram determinadas através de ensaio que mede os sítios de ligação e atividade catalítica da enzima, ensaio de decatenação do DNA e método espectrofotométrico, respectivamente. Estando a toxicidade no DNA envolvida no mecanismo de ação das duas drogas, também relacionamos as respostas celulares com a introdução de danos ao DNA por método fluorescente. Para melhor entendermos as interações entre as drogas, examinamos os efeitos da exposição à IC20, IC50 e/ou IC80 do CPT-11 ou 5-FU por 2 h ou 24 h em alvos celulares possivelmente relacionados com a citotoxicidade destes agentes. Estes incluem: capacidade de reparo por excisão do 10 DNA, distribuição das células nas fases do ciclo celular, integridade da membrana plasmática e formação de complexos DNA-topoisomerase I. Para isto, utilizamos método de incorporação de [3H-metil]timidina, citometria de fluxo, liberação de lactato desidrogenase (LDH) no meio de cultura e ensaio de precipitação com SDS, respectivamente. Os estudos de inibição do crescimento celular revelaram valores de IC50 do 5-FU nas linhagens SW620, HT-29 e SNU-C4 de aproximadamente 15, 8 e 2 µM, respectivamente, e do CPT-11 próximos a 2, 2 e 4 µM, respectivamente. As diferentes sensibilidades ao 5-FU nas três linhagens foram determinadas principalmente pela diferença na afinidade ao substrato. As respostas comparáveis obtidas pela exposição ao CPT-11 podem ser explicadas pelo equilíbrio entre as diferentes atividades das enzimas topoisomerase I e carboxil esterase, entre as linhagens. O programa de análise da combinação das drogas mostrou adição ou sinergismo após exposição a IC20 do CPT-11 seguido do 5-FU, nas três linhagens celulares. Por outro lado, o pré-tratamento com IC20 do 5-FU antagonizou a inibição do crescimento mediada pelo CPT-11. Nenhum dos tratamentos simultâneos determinou um aumento na inibição do crescimento nas linhagens SW620 e HT-29; mas mostraram adição ou antagonismo na linhagem SNU-C4. Observamos um significativo acréscimo na introdução de danos ao DNA nas linhagens celulares SW620 e HT-29 somente quando a IC20 do CPT-11 precedeu a IC50 do 5-FU. Já na linhagem SNU-C4, não somente este tratamento, mas também a utilização simultânea dos agentes introduziu mais dano ao DNA. Os tratamentos por 2 h ou 24 h com IC20, IC50, e/ou IC80 do 5-FU ou CPT-11 não causaram mudanças significativas na distribuição das células nas fases do ciclo celular, concentração de LDH no meio de cultura, ou formação de complexos DNA-topoisomerse I. Indicando que alterações nestes processos não estão envolvidas com os efeitos modulatórios dos pré-tratamentos na citotoxicidade das drogas. Entretanto, a incorporação de [3H-metil]timidina no DNA de células tratadas com CPT-11, aumentou em função da dose e tempo de exposição à droga. Este resultado sugere que o dano ao DNA introduzido pelo CPT-11 depende da dose e tempo de exposição podendo ser reparado por mecanismos de excisão. Somente foi observada significativa incorporação de [3H-metil]timidina em células tratadas com IC20 do 5-FU por 2 h, sugerindo que o reparo por excisão só ocorre após exposição por curto período e à doses baixas deste agente. Juntos, os resultados deste estudo mostraram que tanto os efeitos anti-proliferativos quanto a introdução de danos ao DNA pela combinação CPT-11/5-FU em dose baixa e fixa de um agente junto com dose alta do outro, nas linhagens celulares de carcinoma de cólon humano SW620, HT-29 e SNU-C4, dependem da seqüência de administração das drogas. Estes achados podem ter sido determinados pelos diferentes efeitos do tratamento com uma dose baixa dos agentes nos mecanismos de reparo por excisão do DNA.

Utilização de nutrientes energéticos por córtex cerebral de ratos : efeitos de diferentes concentrações de potássio

Glicose é o principal substrato energético no SNC de mamíferos adultos, contudo o cérebro também é capaz de utilizar outros substratos, incluindo manose, frutose, galactose, glicerol, corpos cetônicos e lactato. Glicose é quase totalmente oxidada a CO2 e H2O, mas ela também é precursora de neurotransmissores, tais como glutamato, GABA e glicina. O metabolismo energético do SNC varia ontogeneticamente, visto o fato de que nas primeiras 2 horas após o nascimento, lactato é o seu principal substrato, glicose e corpos cetônicos servem como substratos nos 21 dias subseqüentes e, após este período, somente glicose predomina. A utilização de nutrientes é regulada de várias maneiras, tais como o transporte através das células endoteliais capilares, transporte através da membrana plasmática, variações na atividade enzimática e variações nas concentrações de nutrientes plasmáticos. Está bem estabelecido que a atividade funcional do SNC aumenta o metabolismo energético. Tal evento pode ser dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase, a qual é requerida para restabelecer a homeostase iônica. O aumento da concentração de potássio extracelular de um nível basal 8-12 mM provoca excitação neuronal fisiológica. A concentração de potássio pode atingir 50-80 mM durante convulsões, isquemia ou hipoglicemia. O potássio liberado pela atividade elétrica é captado nos astrócitos através de processos dependentes e não dependentes de ATP. Neste estudo, observamos o efeito de diferentes concentrações de potássio extracelular (2.7, 20 e 50 mM), sobre a oxidação de glicose, frutose, manose e lactato a CO2 e a conversão a lipídios em córtex cerebral de ratos jovens (10dias) e adultos (60 dias). Considerando que a captação de deoxiglicose está relacionada com a atividade glicolítica, testamos a influência do potássio extracelular sobre este parâmetro. Os efeitos da ouabaína sobre a oxidação de glicose e captação de deoxiglicose foram testados para determinar se a influência de potássio extracelular era dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase. Os efeitos da monensina (ionóforo de Na+) e bumetanide (inibidor do transportador de Na+/K+/2Cl-) foram também testados. O aumento da concentração de potássio extracelular aumentou a oxidação de glicose, frutose, e manose a CO2 em córtex cerebral de ratos adultos, contudo, este fenômeno não foi observado em ratos jovens. A oxidação de lactato aumentou com o aumento da concentração de potássio extracelular em ambos ratos jovens e adultos. Não houve diferença na oxidação de glicose e sobre a captação de deoxiglicose na presença de ouabaína. Monensina aumentou a captação de deoxiglicose em 2 minutos de incubação. Contudo, esta captação diminuiu em períodos de incubação de 1 hora e 10 minutos. Além disso, não houve efeito do bumetanide sobre o aumento causado pela alta concentração de potássio extracelular na oxidação de glicose.

Atividade de tirosina quinase e expressão do substrato 1 do receptor de insulina (IRS-1) em miométrio e mioma humanos

Objetivos: determinar a atividade de tirosina quinase do receptor de insulina- fosforilação de substrato exógeno poly (Glu 4: Tyr 1)- e expressão do susbtrato do receptor de insulina 1 em miométrio normal e mioma. Delineamento: estudo experimental. Pacientes: mulheres com miomas submetidas a histerectomia. Intervenção: frações de membrana plasmática células de miométrio e mioma foram preparadas e a seguir as amostras foram estimuladas com e sem insulina e incubadas com o substrato exógeno poly (Glu 4: Tyr 1). Para estudar a expressão de IRS-1, lisato total dos tecidos foi utilizado. Western blots utilizando anticorpos específicos foram realizados. Principais medidas: medida da incorporação de radioatividade (32P-ATP) nas frações de membrana plasmática incubadas com e sem insulina. Quimioluminescência seguida por densitometria foi usada para avaliar expressão de IRS-1. Resultados: níveis de IRS-1 em miométrio (0,190 ± 0,022) e mioma (0,226 ± 0,022) não foram diferentes (p > 0,05). A fosforilação do substrato exógeno poly (Glu 4: Tyr 1) também não foi diferente entre miométrio (1,566 ± 0,177) e em mioma (1,98 ± 0,612) (p > 0,05). Conclusão: a expressão protéica de IRS-1 não foi diferente entre miométrios e miomas. A capacidade de fosforilar substratos exógenos com resíduos de tirosina foi semelhante em miomas e miométrios. Outras etapas da via de transdução do sinal da insulina podem estar envolvidas na proliferação alterada dos miomas.

Alterações bioquímicas e comportamentais em ratos submetidos ao modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia

A homocistinúria é uma doença metabólica hereditária causada pela deficiência severa na atividade da enzima cistationina β-sintase e é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo tecidual de homocisteína e metionina. Retardo mental, deficiência cognitiva, isquemia, convulsões e aterosclerose são achados clínicos comuns em pacientes homocistinúricos. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença são pouco conhecidos. Modelos animais experimentais de erros inatos do metabolismo são úteis para compreender a fisiopatologia dessas doenças em humanos. No nosso laboratório, já foram criados alguns modelos animais de algumas doenças metabólicas hereditárias, como, por exemplo, fenilcetonúria e hiperprolinemia tipo II. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental responsável pela manutenção do gradiente iônico necessário para a excitabilidade neuronal e consome de 40 a 60% do ATP formado no cérebro. Essa enzima é inibida por radicais livres e sua atividade está diminuída na isquemia cerebral, epilepsia e em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. A diminuição de energia cerebral e o estresse oxidativo têm sido associados com algumas doenças que afetam o sistema nervoso central, como as doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington e isquemia cerebral. Por outro lado, a homocisteína tem sido considerada um fator de risco para o aparecimento dessas doenças. No sentido de ampliar o conhecimento das alterações bioquímicas envolvidas na gênese da disfunção neurológica característica da homocistinúria, esse trabalho teve como principal objetivo desenvolver um modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia em ratos. Utilizando esse modelo, verificamos a atividade da Na+,K+-ATPase e alguns parâmetros de metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase) em hipocampo de ratos. A aprendizagem e a memória na tarefa do labirinto aquático de Morris foram avaliadas em ratos submetidos ao modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia. Nesse trabalho, também estudamos o efeito in vitro dos metabólitos acumulados na homocistinúria, homocisteína e metionina, sobre a atividade da Na+,K+-ATPase e sobre alguns parâmetros de metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividade da enzima citocromo c oxidase). Além disso, o efeito in vitro da homocisteína sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo (potencial antioxidante total (TRAP), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e atividades das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase) em hipocampo de ratos foi investigado. O tratamento crônico foi realizado do 6o ao 28o dia de vida, através de administrações subcutâneas de homocisteína, duas vezes ao dia, com intervalos de 8 horas. As doses de homocisteína administradas foram escolhidas com o objetivo de induzir concentrações plasmáticas de 0,4 a 0,5 mM, semelhantes àquelas encontradas em pacientes homocistinúricos. Através desse tratamento, também foram induzidas concentrações elevadas de homocisteína no cérebro de ratos. Os controles receberam solução salina em volumes semelhantes. Os resultados mostram que a administração crônica de homocisteína inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica, a produção de CO2 e a captação de glicose, assim como as atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase em hipocampo de ratos. Os animas tratados com homocisteína também apresentaram diminuição de memória na tarefa do labirinto aquático de Morris. Além disso, a homocisteína e a metionina inibiram a atividade da Na+,K+-ATPase de hipocampo de ratos in vitro. Estudos cinéticos sobre a inibição da Na+,K+-ATPase, causada pela homocisteína, também foram realizados. Os resultados mostraram que a homocisteína inibe a enzima de forma não-competitiva com o ATP como substrato. Também foi verificado que a incubação de homogeneizados de hipocampo com homocisteína diminuiu a atividade da Na+,K+-ATPase e que a incubação simultânea com alguns antioxidantes, tais como glutationa, ditiotreitol, cisteína e a enzima antioxidante superóxido dismutase preveniram esse efeito. Os metabólitos acumulados na homocistinúria também alteraram alguns parâmetros de metabolismo energético cerebral (produção de CO2 e lactato, captação de glicose e atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase) in vitro. Além disso, verificou-se que a homocisteína in vitro diminuiu o TRAP e aumentou a quantidade de TBARS, um marcador de lipoperoxidação, mas não alterou as atividades das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase. Os achados sugerem que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase, a diminuição do metabolismo energético e o aumento do estresse oxidativo podem estar relacionados com as disfunções neurológicas características dos pacientes homocistinúricos.

Percoll e plasma seminal na preservação do sêmen eqüino a +4º C

O presente estudo visou verificar o efeito sobre alguns parâmetros da seleção por gradiente de Percoll® e da adição de plasma seminal do sêmen eqüino preservado a +4oC. O primeiro experimento avaliou a taxa de recuperação de espermatozóides após seleção por Percoll® em diferentes protocolos de centrifugação. Foram realizadas 5 coletas de sêmen de um garanhão. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade, vigor e concentração. Foram retiradas duas amostras de 4 mL, diluídas em leite desnatado UHT com concentrações de 50 e 100 x 106 espermatozóides por mL cada. Cada uma destas amostras foi dividida em 4 alíquotas de 1 mL, que foram então colocadas sobre Percoll® e submetidas a diferentes tempos e velocidades de centrifugação. V1 - 200 g (5 min) + 800 g (10 min); V2 - 800 g (10 min); V3 - 800 g (15 min); V4 - 800 g (20 min). Após esse processo, o sobrenadante foi desprezado e o pellet de cada alíquota ressuspendido com 0,5 mL de leite UHT. As 8 amostras foram novamente avaliadas para concentração, motilidade e vigor. O segundo experimento estudou o efeito da adição de plasma seminal de diferentes qualidades ao sêmen eqüino selecionado por gradiente de Percoll® e resfriado a +4°C por até 72 horas. Foram utilizados 40 ejaculados de 4 garanhões, sendo dois com boa qualidade de sêmen e dois com baixa qualidade de sêmen. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade, vigor e concentração e preparadas cinco frações de 100x106 espermatozóides, diluídas 1:1 (v/v) em EDTA-Glicose. Quatro delas, constituídas por 1mL a 2mL, foram depositadas sobre Percoll®. A fração restante foi centrifugada em tubo de vidro de 10 mL, sob as mesmas condições de tempo e velocidade das demais amostras. Foi realizada centrifugação por 5 minutos em 200 g, seguida de 10 minutos em 800 g. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido com leite UHT desnatado compondo os seguintes tratamentos: Sp: 1,5 mL de leite UHT desnatado sem adição de plasma seminal; Hp: 1,425 mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L de plasma seminal homólogo; Ap: 1,425 mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L de plasma seminal do pool de alta qualidade; Bp: 1,425mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L plasma seminal do pool de baixa qualidade; Cc: foi centrifugada sem seleção por Percoll®, teve seu sobrenadante descartado e ressuspendida com 2 mL de leite UHT; C : uma amostra de sêmen diluído em leite UHT foi mantida como controle no processo de armazenamento. As amostras foram resfriadas a +4°C e examinadas a cada 24h até as 72 horas em relação à motilidade, funcionalidade de membrana (teste hiposmótico) e integridade de membrana (CFDA/PI). A seleção por gradiente descontínuo de Percoll® 90/45% mostrou-se efetiva na recuperação de espermatozóides com motilidades progressiva e total. A adição de 5% de plasma seminal ou a ausência de plasma não influenciaram os valores da motilidade das amostras selecionadas por gradiente de Percoll®. A seleção por Percoll não influenciou na percentagem de células com membrana plasmática funcional. Concentrações superiores a 2% de plasma seminal resultaram em decréscimo do número de células com membrana funcional, enquanto que as amostras sem plasma seminal apresentaram os melhores resultados e o grupo controle, que apresentava a maior percentagem de plasma, os piores. A utilização de Percoll® não separou células com alteração de membrana. A percentagem de células com membrana completamente íntegra foi significativamente maior nas amostras que sofreram processo de centrifugação, independentemente da seleção. O processo de seleção por Percoll® foi efetivo na recuperação de espermatozóides de eqüino com motilidade progressiva, mas não selecionou espermatozóides quanto à funcionalidade nem à integridade de membrana. Concentrações inferiores a 2% de plasma seminal melhoraram a funcionalidade de membrana. A ausência de plasma seminal melhorou os resultados de integridade das membranas plasmática e acrossomal; e a adição de plasma de alta qualidade não melhorou a motilidade de espermatozóides selecionados por Percoll®.

Efeito in vitro das substâncias acumuladas na doença de Lesch-Nyhan sobre a atividade da Na+,K+-ATPase em estriado de ratos

A doença de Lesch-Nyhan é um erro inato do metabolismo das purinas caracterizado pela deficiência na enzima hipoxantina- guanina fosforibosiltransferase. O bloqueio dessa reação resulta no acúmulo tecidual de hipoxantina, xantina e ácido úrico. A doença caracteriza-se por hiperuricemia, variado grau de retardo mental e motor, espasticidade e auto-mutilação. No sistema nervoso central, a Na+, K+ - ATPase é responsável pela manutenção da homeostase dos íons Na+ e K+, regulando o volume celular, a excitabilidade neuronal, o transporte de neurotransmissores e outras moléculas. Evidências na literatura demonstram que a redução na atividade da Na+, K+ - ATPase está relacionada com diversas doenças neurodegenerativas, tais como isquemia cerebral e doenças de Parkinson e de Alzheimer. No presente estudo, investigamos o efeito in vitro da hipoxantina, xantina e ácido úrico sobre a atividade da Na+, K+- ATPase em membrana plasmática sináptica de estriado de ratos. Estudamos, também, a cinética de inibição causada pela hipoxantina e de interação entre hipoxantina, xantina e ácido úrico. Nossos resultados demonstram que hipoxantina, xantina e ácido úrico inibem significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. O estudo dos mecanismos de inibição da atividade enzimática causados pela hipoxantina demonstrou um efeito inibitório não competitivo com o substrato ATP. Além disso, o estudo de interação cinética entre hipoxantina, xantina e ácido úrico sugere que esses compostos atuem em um mesmo sítio de ligação na enzima. Verificamos, também, o efeito da preincubação de homogeneizado de estriado de ratos na presença de hipoxantina (10 µM) sobre a atividade da Na+, K+- ATPase de membrana plasmática sináptica com a adição ou não de antioxidantes (glutationa e trolox), bem como alguns parâmetros de estresse oxidativo denominados TBARS (medida de lipoperoxidação) e TRAP (capacidade antioxidante tecidual não-enzimática) no intuito de verificar a participação do estresse oxidativo nos mecanismos de inibição enzimática provocados pela hipoxantina. Os resultados monstraram que a hipoxantina inibe significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. Adicionalmente, nossos resultados demonstraram que glutationa, mas não o trolox, na concentração de 1 mM, foi capaz de prevenir a inibição enzimática causada pela hipoxantina. Nossos resultados também mostraram que a hipoxantina, na mesma concentração, aumentou TBARS e diminuiu TRAP que essa substância induz o estresse oxidativo. É possível que a inibição na atividade da Na+, K+- ATPase possa estar envolvida nos mecanismos pelos quais as oxipurinas são neurotóxicas. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da disfunção neurológica encontrada em pacientes portadores da doença de Lesch-Nyhan.

Estudo das rotas de síntese dos gangliosídios nos dois fenótipos da célula estrelada hepática

Glicoesfingolipídios (GSL) são constituintes da membrana plasmática e possuem bases de cadeia longa (bases esfingóides) como componente estrutural lipídico. Açúcares podem ser adicionados à ceramida sintetizada de novo (rota 1), sintetizada pela reciclagem da esfingosina (rota 2) e em GSL reciclados através do Golgi (rota 3). A serina palmitoiltransferase (SPT) é a enzima marca-passo e catalisa o primeiro passo na biossíntese de novo destes componentes. A linhagem celular GRX, representativa das células estreladas hepáticas, expressa o fenótipo miofibroblástico e pode ser induzida in vitro a adquirir o fenótipo lipocítico. Ambos fenótipos possuem gangliosídios da série-a (GM2, GM1 e GD1a) bem como o seu precursor GM3, que são expressos como doublets em HPTLC (bandas 1 e 2, respectivamente). Para o estudo da biossíntese dos GSL neste modelo biológico, foram determinadas as condições ideais para a atividade da SPT, e foi avaliada sua atividade na fração microssomal nos dois fenótipos. Também foi determinada a contribuição de cada rota de biossíntese para as duplas bandas. As células foram pré-incubadas com 5mM de -cloroalanina (inibidor da SPT) ou com 25M de fumonisina B1 (inibidor da ceramida sintase) e então, [U-14C]galactose foi adicionada no meio de cultura na presença contínua dos inibidores. Culturas controles (sem inibidores) foram realizadas simultaneamente. Os lipídios foram extraídos, os gangliosídios purificados em colunas Sep-Pack C18 e analisados por HPTLC, a qual foi revelada por auto-radiografia e após, submetida à análise densitométrica. Em ambos fenótipos, a síntese de novo, a reciclagem da esfingosina e a reciclagem pelo Golgi contribuem com a biossíntese dos GSL No miofibroblasto, os doublets dos gangliosídios complexos (GD1a e GM1) são, principalmente, sintetizados pelas rotas de reciclagem; enquanto as bandas do GM2 e do GM3 têm uma participação importante da síntese de novo. No lipócito, as rotas de reciclagem são as mais importantes. Contudo, no lipócito, ambas bandas do GM2 e a banda 2 do GM3 apresentam considerável síntese pela rota de novo. Esta rota tem uma contribuição menor no lipócito do que no miofibroblasto, o que está de acordo com os níveis da atividade da SPT detectados nestes fenótipos. Isto sugere que os fenótipos miofibroblasto e lipócito utilizam pools de ceramida distintos para a síntese de seus GSL e que apresentam importantes diferenças entre as rotas biossintéticas, o que pode se refletir no seu comportamento celular.

Papel dos gangliosídios de células estromais sobre a proliferação e sobrevivência de células precursoras mielóides

A mielopoiese depende do estroma mielossuportivo tanto no que diz respeito a produção de fatores de crescimento como de proteoglicanos de heparan-sulfato. O ambiente intercelular formado entre células do estroma e células progenitoras mielóides possui características ácidas, conferidas por moléculas carregadas negativamente e sensíveis a sialidase. Gangliosídios, glicoesfingolipídios contendo pelo menos uma molécula de ácido siálico, têm sido relacionados à modulação de fatores de crescimento e à diferenciação de células hematopoiéticas. Neste trabalho, estudamos a produção, a distribuição e o papel dos gangliosídios em um modelo experimental in vitro de mielopoiese dependente do estroma derivado de fígado fetal murino AFT-024. Utilizamos como sistema de resposta para o monitoramento da disponibilidade e atividade local de GM-CSF a linhagem celular precursora mielóide FDC-P1, a qual é dependente de GM-CSF para sua sobrevivência e proliferação. O GM3 foi o principal gangliosídio produzido pelo estroma, mas não pelas células mielóides, sendo requerido para que a função mielossuoprtiva do estroma seja ótima. Este gangliosídio foi liberado para o sobrenadante de cultura das células AFT-024 e seletivamente incorporado pelas células progenitoras mielóides, onde foi segregado em rafts e colocalizou-se com a cadeia α do receptor de GM-CSF. Além disso, o gangliosídio GM3 foi encontrado na fração insolúvel de células AFT-024 tratadas com Triton X-100 a 4°C, estando presente também nas frações menos densas do fracionamento em gradiente de sacarose, indicando sua presença em rafts. O GM3 captado pelas células FDC-P1 foi metabolizado, gerando gangliosídios das séries a e b, da mesma forma que o GM3 endógeno. Nestas células, o GM1 é o principal gangliosídio, também sendo encontrado na interface entre estroma e células mielóides, mas com colocalização apenas parcial com a cadeia α do receptor de GM-CSF. As imagens de imunocitoquímica ainda revelaram que o GM1 não apresenta colocalização significante com a cadeia β do receptor de GM-CSF, com o gangliosídio GM3, ou com CD44. Em um outro grupo de experimentos, analisamos o perfil de síntese e shedding de gangliosídios em um estroma derivado de medula óssea, a linhagem celular S17; na linhagem celular GRX, derivada de células estreladas hepáticas isoladas de reação fibro-granulomatosa inflamatória; e em cultivos primários de fibroblasto de pele murinos. Além disso, comparamos a habilidade destes estromas para sustentar a sobrevivência e a proliferação das células precursoras mielóides. A concentração de ácido siálico reflete a capacidade mielossuportiva dos estromas. Embora os diferentes estromas sintetizem os mesmos gangliosídios, existem diferenças no conteúdo relativo de cada gangliosídio. Aparentemente, o GM3 é o principal gangliosídio envolvido na modulação da atividade dos fatores de crescimento. O shedding foi similar ao perfil de síntese de gangliosídios, mas a atividade mielossuportiva dos sobrenadantes foi diferente entre os tipos celulares e em relação a sustentação por contato. No entanto, a proliferação das células FDC-P1 diminuiu em todos os sobrenadantes obtidos de células estromais em que a síntese de gangliosídios foi inibida e onde o gangliosídio GM3 foi neutralizado pelo anticorpo monoclonal anti-GM3. As diferenças encontradas na capacidade de sustentação da proliferação de células progenitoras mielóides por fator de crescimento solúvel ou apresentado podem estar relacionadas a diferenças na concentração de gangliosídios inseridos na membrana plasmática ou liberados para o meio de cultura. Sendo assim propomos que as células do estroma mielossuportivo produzem e secretam os fatores de crescimento necessários e seus cofatores, tais como proteoglicanos de heparan-sulfato. O estroma também fornece gangliosídios, os quais são transferidos do estroma para as célulasalvo, onde geram domínios de membrana específicos contendo complexos macromoleculares que incluem os receptores para fatores de crescimento.

Endotelina-1 plasmática em transplantados renais sob tratamento com ciclosporina

Resumo não disponível.

Obtenção e caracterização de células de membrana sinovial ovina transformadas pelo antígeno T do vírus símio 40: influência na variabilidade dos genes gag e env e do LTR dos vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV) e maedi-visna (MVV) dos ovinos.

Cultivos celulares podem ser utilizados para isolamento viral, caracterização de novas amostras virais e produção de imunobiológicos. Podem ser empregados cultivos celulares primários, secundários ou de linha. Estes últimos podem ser obtidos pela transformação física, química ou biológica de cultivos primários ou secundários. Para verificar a interação entre células transformadas com o Ag T do vírus símio 40 (SV40) e os Lentivírus de Pequenos Ruminantes (SRLV), amostras brasileiras de SRLV foram utilizadas para inoculação em cultivos celulares de membrana sinovial ovina transformados pelo Ag T e comparadas à amostras inoculadas em cultivos não transformados. Inicialmente, as células transformadas pelo Ag T foram caracterizadas e observou-se um aumento na cinética de crescimento e alterações no cariótipo, provavelmente induzidas pela presença do Ag T. Este foi detectado por PCR no núcleo e no citoplasma das células transformadas e sua expressão, confirmada através de RT-PCR. A fim de avaliar a permissividade e a possível seleção de populações virais em células transformadas, dois isolados, um de maedi-visna dos ovinos e um de artrite-encefalite caprina, foram inoculados em células MSO e TMSOpSV1. Através da análise de sequências dos genes gag e env e LTR obtidos por PCR, procurou-se avaliar a variabilidade viral em função do tipo de célula utilizada. Analisando-se as seqüências obtidas pelo método de Maximum Likelihood, embora tenha sido observada variabilidade viral, esta não estava associada ao tipo celular utilizado para inoculação viral.

Efeito hiperpolarizante do isoproterenol na membrana da célula de sertoli de ratos imaturos : envolvimento dos receptores beta2-adrenérgicos e dos canais K+ATP

No presente estudo, foi investigado o mecanismo pelo qual, o isoproterenol hiperpolariza o potencial de membrana (PM) da célula de Sertoli em túbulos seminíferos de ratos, com quinze dias de idade (imaturos). Foram analisadas a modificação do potencial de membrana e a resistência, utilizando-se a técnica de registro intracelular. O isoproterenol (2x10-6M) induziu uma hiperpolarização imediata e significativa na membrana da célula de Sertoli. O antagonista β2-adrenérgico butoxamina (1x10-6M) anulou a ação do isoproterenol. O antagonista β1-adrenérgico metoprolol (1x10-6M) teve efeito de reduzir a ação do isoproterenol, porém sem ser significativo. A inibição dos canais K+ATP, com a sulfoniluréia glibenclamida, suprimiu a ação do isoproterenol. A testosterona, a qual atua despolarizando o potencial de membrana, através do fechamento de canais K+ATP, via PLC-PIP2, impediu a hiperpolarização produzida pelo agonista β-adrenérgico. Os policátions como: espermina e LaCl3 (cloreto de lantâno) reverteram o efeito hiperpolarizante do isoproterenol, despolarizando o potencial de membrana, provavelmente através de interações iônicas que neutralizam a ação do agonista β-adrenérgico nos canais K+ATP. O agonista da adenilato ciclase, forscolina (1x10-7M), rapidamente hiperpolariza o potencial de membrana da célula de Sertoli, mimetizando o efeito do isoproterenol; db-AMPc também hiperpolariza o potencial de membrana destas células. Estes efeitos indicam que o isoproterenol age nos canais K+ATP, provavelmente, envolvendo a cascata: receptor β-adrenérgico/Gs/AC/AMPc/PKA. Estes resultados sugerem que a hiperpolarização induzida por isoproterenol é mediada pela abertura de canais K+ATP, em células de Sertoli. Esta hiperpolarização β-adrenérgica, provavelmente, tem uma papel fisiológico, na modulação do potencial de membrana, opondo-se à despolarização produzida pela testosterona, através do fechamento dos canais K+ATP.